本研究应用人生就是博-尊龙凯时品牌的µ-SlideILuer 08通道载玻片（编号：80196）在静态条件下进行细菌生物膜的培养，结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与扫描电子显微镜（SEM）进行成像分析。首先，将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DSM 50071T接种至µ-SlideILuer 08通道载玻片中，培养三天。为促进细胞附着及生物膜的形成，培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞。

为确认生物膜的形成，在生长培养基中添加了无毒光学示踪剂EbbaBiolight680。该示踪剂适用于活细胞成像，能够与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合并发出红色荧光，为细菌生物膜提供可视化标记。在DAPI染色后，通过成像CLSM结果显示，细菌细胞以单层或双层结构附着，同时发出的荧光信号增强，使得更厚的生物膜结构得以识别。

本实验旨在整合多种成像技术于同一载玻片上，从而实现更全面的分析。因此，在CLSM成像后，将细胞固定，并进行脱水处理，之后干燥以备SEM成像。实验室自制的3D模具用于分离盖玻片，以确保在操作过程中不破坏贴壁细胞的空间结构。随后，在分离的盖玻片上，对形成的细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像。

材料与试剂

• 铜绿假单胞菌培养物Pseudomonas aeruginosa culture（DSMZ，50071）
• 胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）
• 大豆蛋白胨（Millipore，107212）
• 葡萄糖（VWR，24379）
• 氯化钠（NaCl，VWR，27800）
• 磷酸氢二钾（K₂HPO₄, Sigma, P3786）
• 磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）
• EbbaBiolight680（Ebba Biotech AB）
• 4',6-Diamidino-2-Phenylindole（DAPI, stock conc 1mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248）
• 25%戊二醛（Sigma，G7776）
• 去离子水（diH₂O）
• 无水乙醇（Sigma，34852-M）

实验步骤

在实验开始前，将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM50071）接种于LB培养基，在30°C、160转/分钟进行过夜培养。根据供应商说明，将培养物以1:100比例稀释，并添加1:1000光学示踪剂。实验设计需要在无菌条件下进行，确保细胞质量。

当操作µ-SlideILuer 08时，需平衡材料于30°C培养箱中，防止温差导致气泡。步骤包括将200µL稀释菌液注入载玻片，并静置于室温下，确保细胞沉降并附着。随后更换培养基以保持细胞的生长状态，并在适当的温度下进行静培，最终确认细胞附着情况及生物膜的形成。

染色步骤需在通风橱内进行。通过PBS缓冲液替换原培养基后，再加入DAPI染色液并静置孵育。完成后，通过去离子水和PBS进行清洗，至染料去除充分为止。随后，运用CLSM拍摄附着细胞的图像，并将其保存于4°C待后续分析。

SEM样品制备同样在µ-SlideILuer 08上进行，过程需在通风橱中。通过使用戊二醛固定细胞，并进行脱水处理，在55°C的培养箱中干燥待用。同时需将样品切割并镀金，以用于电镜观察。这样，结合人生就是博-尊龙凯时的实验材料和技术，我们能够准确分析细菌生物膜的结构与功能。