粒曼专注于提供细胞体外基因敲除的解决方案，致力于为客户定制基因敲除服务。截止目前，我们已推出多项专业的细分敲除服务，欢迎随时咨询粒曼团队，以获取技术路线及成功案例资料。

细胞基因敲除服务概述

粒曼为真核细胞体外基因敲除提供定制服务，团队将定期更新常见问题解答（Q&A），以更好地满足客户需求。以下是本次更新的Q&A【2503版】中的部分问题：

基因敲除服务常见问题

1-20问涉及基因敲除的服务相关问题，请参考服务指南以及粒曼高通量基因敲除定制服务（RNP法）资料。

关键问题解答

21. 如何验证基因敲除是否成功？

22. 精准敲除和模糊敲除有什么区别？
（1）精准敲除：通过同源重组（HDR）机制，在目标基因中引入精确修饰，使基因功能完全或部分失活。粒曼提供精准敲除定制服务，针对靶基因特定区域进行核苷酸序列的敲除、敲入及突变。
（2）模糊敲除：通过非同源末端连接（NHEJ）机制，在目标基因指定区域随机引入插入或缺失突变，导致基因编码框移位或提前终止密码子，从而损害基因功能。

23. CRISPR/Cas9方法可以敲除的最大片段范围大约有多少？
理论上可敲除范围为1kb-1Mb，通过结合多靶点切割技术或其他技术（如CRISPRa/i、表观遗传修饰），可实现超大片段敲除（最高可达1Mb）。

24. 如何提高原代细胞的编辑效率？
方法包括使用病毒载体（如慢病毒/AAV）、电场诱导膜穿孔、核转染、以及使用脂质纳米颗粒对Cas9-sgRNA复合物进行包裹等。

25. 如何提高基因敲除效率？

26. 如何分析基因敲除后的表型变化？

27. 如何区分纯合敲除与杂合敲除？

28. CRISPR RNP法适用的细胞及场景有哪些？

总结

CRISPR/Cas9 RNP基因编辑法通过将针对靶基因的多条sgRNA与Cas9蛋白体外混合形成核糖核蛋白复合物（RNP），以瞬时转染方式将RNP递送至细胞，获得高效、稳定的遗传细胞池。与传统的慢病毒/质粒方法相比，这种新方法减少了基因组的不稳定性和脱靶风险。由于RNP在72小时内完成基因组编辑后便会被降解，因此极大地保持了细胞表型的稳定性，使其成为当今脱靶效应最小的技术。由此可见，CRISPR/Cas9 RNP法在基因敲除细胞系构建领域已逐步成为主流。

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